Izolace kyseliny

  Izolace kyseliny jantarové z produkčního média

Cena procesu izolace produktu se v případě kyseliny jantarové odhaduje na více než 60 % z celkových výrobních nákladů.

Hlavní komplikací izolace je poměrně nízká finální koncentrace, přítomnost vedlejších produktů (včetně jiných karboxylových kyselin) a požadavek na kontrolu pH během fermentace, který vede k tvorbě karboxylové kyseliny ve formě soli (Orjuela a kol., 2011).

Samotný proces purifikace je obtížný, protože podle fyzikálně-chemických vlastností mají organické kyseliny s krátkým řetězcem v roztoku podobné chování. Co se týče kyseliny jantarové, pKa1 je 4,21 a pKa2 je 5,64. Pro kyselinu mléčnou, je hodnota pKa 3,86, pKa kyseliny octové je 4,7 a pKa kyseliny mravenčí je 3,84 (Li a kol., 2010).

Během rozsáhlého výzkumu v této oblasti bylo od roku 1980 do současnosti vyvinuto několik patentovaných postupů pro účinnou izolaci kyseliny jantarové. Tyto metody, viz. tabulka 2, mohou být klasifikovány do několika skupin: metody využívající přímé srážení (ve formě solí), extrakci (rozpouštědla, aminy), výměnu  iontů, membránovou elektrodialýzu nebo esterifikaci volné kyseliny a její následnou hydrolýzu. Ve všech případech je klíčovým krokem okyselení solí (Orjuela a kol., 2011).

Tabulka 2. Přehled patentovaných postupů pro izolaci kyseliny jantarové (Orjuela a kol., 2011).

Proces	Poznámka	Výnos, %
Okyselení-krystalizace	Selektivní precipitace s Na2SO4	74
Reaktivní extrakce	Organická rozpouštědla (ketony)	84
	Oktanol	80
Extrakce aminy	Pod CO2 atmosférou, rozpouštědlo alkohol	80
Výměna iontů	Zpětná extrakce	87
Nanofiltrace		0
Membránová elektrodialýza		79
Esterifikace s reaktivní destilací	Amonná sůl s butanolem, katalyzátor P-TSA	96,5

Oddělení žádané kyseliny ze směsi karboxylových kyselin není snadné. Možností je např. přídavek Ca(OH)₂ pro neutralizaci fermentačního média, čímž zároveň dojde k vysrážení sukcinátu ve formě jeho soli. Sukcinát vápenatý se oddělí filtrací a po přidání kyseliny sírové se volná kyselina jantarová opět uvolní ze sraženiny. Při tomto postupu však dochází k hromadění velkého množství CaSO₄ a laktátu vápenatého (Li a kol., 2010).

V případě výroby chemických látek, jako je tetrahydrofuran a 1,4-butandiol, jsou estery sukcinátu více žádoucí, než volné kyseliny, protože jsou těkavé a teplotně stabilní (Orjuela a kol., 2011).

Další metodou izolace kyseliny jantarové z fermentačního média je přímá esterifikace sukcinátových solí v ethanolu (EtOH). Fermentační médium se zpracovává obvykle odstředěním biomasy a přidáním aktivního uhlí. Tím dochází k částečnému odstranění nečistot, jakými jsou např. proteinové fragmenty či barevné látky. Následně se vlhké soli nechají reagovat s ethanolem za účasti minerální kyseliny (např. H₂SO₄) (Orjuela a kol., 2011). Celý proces je znázorněn na obrázku 8.

Obrázek 8. Proces izolace kyseliny jantarové z fermentačního média pomocí esterifikace ethanolem (Orjuela a kol., 2011).

Z chemického pohledu, sušená jantarová sůl reaguje s H₂SO₄ za vzniku volné kyseliny jantarové a odpovídajícího síranu. Nezreagovaná nebo přebytečná H₂SO₄ se chová jako katalyzátor pro esterifikaci rozpuštěné volné kyseliny s EtOH. Vzniká tak směs mono- a diethyl sukcinátů (MES a DES), spolu s volnou kyselinou. Síran sodný je nerozpustný v ethanolu. Vysráží se proto spolu s vázanou vodou, protože má tendence tvořit hydráty. Tyto reakce probíhají současně v průběhu okyselování a jsou závislé na teplotě, koncentraci H₂SO₄ a času. Když je okyselení kompletní, sukcinát rozpuštěný v ethanolu se dále esterifikuje pomocí reaktivní destilace za vzniku požadovaného diethyl-sukcinátového produktu (Orjuela a kol., 2011).

Omezená rozpustnost sukcinátu a síranových solí v roztocích ethanolu obsahujících méně než 20 % vody tvoří základ pro využití sukcinátových esterů. Sušené sukcinátové sole se okyselí v ethanolu pomocí H₂SO₄, čímž vznikají estery a volná kyselina jantarová. Jiné kyseliny, vytvořené při fermentaci, se také uvolní ze solí. Nerozpustné anorganické sírany vzniklé při okyselení v ethanolu se následně snadno odstraní filtrací nebo odstředěním. Výtěžnost sukcinátu při esterifikaci přesahuje 95 %. Separaci pomocí ethanolu je navíc možné integrovat do celkového procesu výroby díky tomu, že diethyl-ester kyseliny jantarové se vytváří přímo ze sukcinátových solí v průběhu fermentace (Orjuela a kol., 2011).

Aminy s velkou molární hmotností jsou vyznamnými extraktanty pro organické kyseliny. Z tohoto důvodu byla, jako první krok izolace a purifikace kyseliny jantarové, studována reaktivní extrakce smícháním vodných roztoků kyseliny jantarové s 448 různými směsmi amin-rozpouštědlo. Extrakční činidla se skládají buď z aminu a jednoho rozpouštědla nebo ze dvou aminů a dvou rozpouštědel. Maximální extrakční výtěžky kyseliny jantarové (více než 95 %) z vodného roztoku s 423 mM kyseliny jantarové při pH 2,0 byly získány s trihexylaminem rozpuštěným v 1-oktanolu nebo se směsí dihexylaminu a diisooctylaminu rozpuštěných v 1-oktanolu a 1-hexanolu. V důsledku zvýšené iontové síly fermentačního supernatantu a koextrakce jiných organických kyselin, které představují typické vedlejší produkty fermentace, vede uplatnění těchto optimalizovaných reaktivních extrakčních systémů k extrakčnímu výtěžku 78-85 %, (Kurzrock a kol., 2011).

Použitím nižšího pH, než je pK_a1 kyseliny jantarové (4,17), lze docílit dalšího zvyšení výtěžnosti procesu reaktivní extrakce. Z tohoto důvodu by mělo smysl, zaměřit se na optimalizaci kmene a fermentačního procesu výroby kyseliny jantarové za podmínek nízkého pH. Další důležitou otázkou je značný účinek přítomných iontů a jiných organických kyselin na výnos čisté kyseliny jantarové. Vývoj fermentačních způsobů výroby kyseliny jantarové by se tedy měl zaměřit také na minimalizaci iontové síly (přídavek solí do fermentačního média)  (Kurzrock a kol., 2011).

Reaktivní extrakční postupy zahrnují účinné procesy zpětné extrakce pro izolaci extrahované kyseliny jantarové z organické fáze. Vývoj účinných reverzních extrakčních procesů v kombinaci s krystalizací izolované kyseliny jantarové, je v současné době ve stádiu výzkumu. Cílem těchto studií je snaha o dosažení celkové recyklovatelnosti organické fáze s rozpuštěnými aminy (Kurzrock a kol.,2011).

Z ekonomického hlediska vyhodnější, je dvoustupňový ELM (Emulsion Liquid Membrane) proces, během kterého se v prvním kroku odděluje kyselina octová od kyseliny jantarové a ve druhém ELM kroku se kyselina jantarová extrahuje z média. Během procesu se z roztoku odstranní většina kyseliny octové. Její koncentrace ve stripovací fázy je čtyřikrát vyšší než koncentrace ve fázi původní. Obecně platí, že sekundární nebo terciární aminová extrakční činidla jsou typickými nosiči karboxylových kyselin v ELM systémech. Reakce aminů s nedisociovanou kyselinou jantarovou je vyjádřena následujícím vztahem: m mol nedisociované kyseliny jantarové reaguje s n molů nosiče a na externím rozhraní mezi vodným fermentačním médiem a membránovou fází se vytváří 1 mol komplexu kyseliny s extraktantem. Komplex pak difunduje fází membrány na vnitřní rozhraní mezi membránou a vodní fází, kde je nedisociovaná kyselina jantarová uvolněna do stripovací fáze. Amin bez náboje difunduje zpět (Lee 2011).

Povrchově aktivní látka, bissukcinimid polyamin (C9232), je komerční dispergační činidlo na bázi polyalkenu. Sekundární a terciární amin funguje jako druhý nosič a emulgátor v ELM systému. Nicméně, Amberlite LA-2, je silnější, než nosič C9232. Při využití vysoce koncentrovaného roztoku Na₂CO₃, jako stripovací fáze, může být značné množství kyseliny jantarové akumulováno díky vysokému gradientu vodíkových iontů mezi dvěma vodnými fázemi právě ve stripovací fázy. To poskytuje velkou hnací sílu pro extrakci kyseliny jantarové v ELM systému (Lee 2011).

Elektrodialýza slouží k izolaci sukcinátu ze směsi neionizovaných sloučenin za použití iontoměničových membrán (Li a kol., 2010).

Adsorpce je široce používána pro separaci organických kyselin, výhody tohoto procesu jsou rychlé uvolnění kyselin a krátká doba regenerace sorbentu (Li a kol., 2010).

Způsob destilace za sníženého tlaku se používá k odstranění těkavých karboxylových kyselin (např. kyselina octová, kyselina mravenčí). Proces probíhá při hodnotě pH 4,2 a teplotě 60 ^◦C. Poté se kyselina jantarová krystaluje z matečného roztoku (Li a kol., 2010).

Kyselina jantarová může byt izolována ze směsi organických kyselin ve fermentačním médiu také přímou krystalizací (Li a kol., 2010).

Buňky se oddlělují centrifugací po dobu 20 minut při 8000 otáčkách za minutu. K filtrátu fermentačního média se přidá aktivní uhlí (20%, v/v). Dochází tak k odbarvení a odstranění zbytků zdrojů uhlíku nebo bílkovinných nečistot. Suspenze se zfiltruje a nasledně je získána kyselina jantarová buďto přímou metodou krystalizace (Proces I) nebo metodou srážení vápníkem (Proces II). Schéma procesu je znázorněno na obrázku 9 (Li a kol., 2010).

 

Obrázek 9. Schéma dvou procesů izolace kyseliny jantarové: I přímá destilace, II vysrážení pomocí Ca(OH)₂ (Li a kol., 2010).

V procesu I bylo pH média upraveno na hodnotu 2,0 přídavkem 35% (v/v) kyseliny chlorovodíkové. Poté se čerstvé filtrované fermentační médium zchladí na 2-4 ^◦C, a kyselina jantarová se krystalizuje do konstantní hmotnosti v krystalizátoru s rychlostí míchání 90rpm po dobu nejméně 5 hodin. Krystaly jsou dále odděleny centrifugací po dobu 10 minut při 8000 otáčkách za minutu a 4 ^◦C (Li a kol., 2010).

V procesu II se pomalu přidává 25 až 33% (v/v) suspenze Ca(OH)₂ do zfiltrovaného fermentačního média a smíchává se při 300 rpm, dokud hodnota pH nedosáhne 12,5. Pevný sukcinát vápenatý se několikrát promyje destilovanou vodou. Volná kyselina se následně získává ze sukcinátu vápenatého přidáním H₂SO₄(40 až 60% obj.). Přídávání kyseliny sírové se zastaví, když pH dosáhne přibližně hodnoty 2,0. Filtrát je dále přiváděn do anexové kolony s průtokem 1ml min^-1. Jako eluční činidlo pro uvolnění kyseliny jantarové z adsorbentů byl vybrán roztok HCl. Eluát je sušen při teplotě 60 °C přes noc pro získání krystalů jantarové kyseliny (Li a kol., 2010).

Kyselina mléčná, mravenčí a octová ve svých kyselých formách nebo ve formě solí, jsou rozpustné ve vodě při různých hodnotách pH. Rozpustnost kyseliny jantarové také podstatně závisí na hodnotě pH v důsledku tvorby různých disociovaných forem (obrázek 10). Kyselina jantarová a sukcinát mají výrazně odlišnou rozpustnost také v závislosti na teplotě.  Při pH 4,0 je v roztoku 61% nedisociované kyseliny jantarové, 38 % jednomocného aniontu sukcinátu  a 1 % dvojmocného aniontu sukcinátu. Při hodnotách pH menších než 2,0 je kyselina jantarová ve formě své volné kyseliny s rozpustností 73 g l^-1(Li a kol.,2010).

Obrázek 10. Diagram závislosti rozpustnosti kyseliny jantarové, sukcinátu^- a sukcinátu^2-na pH (Li a kol., 2010).

Obrázek 11. Křivka závislosti rozpustnosti kyseliny jantarové při teplotě 25 ^◦C na pH (Li a kol., 2010).

Jak je znázorněno na obr. 11 a 12, sukcinát je mnohem více rozpustný ve vodě než kyselina jantarová. Rozpustnost kyseliny jantarové a její disociovaných forem se výrazně snížuje při poklesu teploty, přičemž kyselina jantarová je mnohem méně rozpustná než odpovídající soli. Při 4 ^◦C je rozpustnost sukcinátu téměř 200 g l^-1, zatímco rozpustnost kyseliny jantarové jen 30 g l^-1 (Li a kol., 2010).

Obrázek 12. Křivka závislosti rozpustnosti kyseliny jantarové a sukcinátu sodného na  teplotě (Li a kol., 2010).

V procesu bakteriální produkce organických kyselin se fermentace provozuje za neutralního pH. Náklady na neutralizaci jsou malé ve srovnání s náklady na konverzi soli na volnou kyselinu.

Rozpustnost sukcinát^- nebo sukcinát^2-se značně liší při různých hodnotách pH. V podmínkách fermentačního procesu, kdy pH bylo udržováno na hodnotě 6,8, bylo složení roztoku kyseliny jantarové následující: 93,5 % sukcinát^2-, 6,4 % sukcinát^- a 0,1 % volné kyseliny. Při pH 2,0: 0,6 % sukcinát^1- a 99,4 % volné kyseliny. Při nízkém pH a teplotě může být kyselina jantarová krystalizována, zatímco ostatní kyseliny a vedlejší produkty budou stále plně rozpustné ve vodě buď ve formě volné kyseliny nebo ve formě soli. Přímá krystalizace (Proces I, obrázek 9) je tak vhodný způsob izolace volné kyseliny jantarové, který by mohl být spojen dalšími účinnými separačními metodami (Li a kol., 2010).

Postup II (obrázek 9), tradiční metoda srážení, má relativně nízký výnos (pouze 52 %) a navíc dochází nevyhnutelně k tvorbě komerčně dále nevyužitelné sádry. V procesu I je čistota získané kyseliny jantarové nižší (90 %), než v procesu II (92 %). V případě příliš rychlé krystalizace je totiž vysoké riziko zachycení nečistot. Krystalizací může být přímo získán požadovaný produkt (v pevné formě nebo ve formě krystalů), bez přidání dalších komponentů. Krystalizace může být považována nejen za konečný krok, ale také za první krok procesu izolace, který by byl efektivním způsobem doplňujícím navazující zpracování (Li a kol., 2010).