Materiál a metody

Mikroskopická kontrola produkčního kmene

Mikroskopická kontrola se provádí před přípravou kryokonzerv nebo před zaočkováním bioreaktoru. Cílem je ujistit se, že nedošlo ke kontaminaci média nežadoucími mikroorganizmy. Kontrola se prováděla prostřednictvím mikroskopu Olympus BX51 s objektivem se zvětšením 1000x za použití imerzního oleje. Při pozorování byl použit fázový kontrast.

 Médium s narostlou bakteriální kulturou Basfia succiniciproducens (sbírkové číslo DSM 22022) se přenáší do vysterilovaného očkovacího boxu. Zde se sterilně z každé baňky připraví mikroskopický preparát. Preparát se sleduje v několika zorných polích, posuzuje se tvar, vzhled buněk, vyrovnanost kultury, přítomnost jiných mikroorganizmů, eventuální přítomnost nečistot apod. Pokud je bakteriální kultura čistá (neobsahuje kontaminující mikroorganismy), použije se pro přípravu zásobních kultur, které pak budou používané pro následující kultivaci.

 Dlouhodobé uchovávání produkčního kmene

 Uchování produkčních kmenů ve formě glycerolových konzerv

Pro bezbečné uchování mikroorganismu při teplotě -70 °C v mrazicím boxu se používá glycerol, který na rozdíl od vody při mrznutí tvoří krystalky menší menší velikosti a díky tomu nedochází k porušování buněčných obalů.

Nejdříve se mikroorganismy pomnoží v médiu. Ve flowboxu se z média do sterilních Eppendorfových zkumavek odebere přiblizně 1 ml narostlé suspenze, pak se k buňkám asepticky přidá 1 ml sterilního glycerolu. Zkumavky se opatrně uzavřou a buňky v roztoku glycerolu se resuspendují na vortexu. Každá zkumavka se označí a takto připravené zásobní konzervy se uchovávají v hluboko mrazicím boxu při teplotě -70 °C. Tato konzerva muže být kdykolív použita v nasledujících pokusech.

 Uchování produkčních kmenů na pevné půdě

Pevné médium se připraví stejně, jako inokulační (přidá se agar v koncentraci 2 % w/v). Médium se vysteriluje v autoklávu 20 minut při 120 °C. Po zchladnutí asi na 80 °C se nalije do Petriho misek. Misky se nechají vychladnout, zalepí se parafilmem a skladují se v lednici.

Pro uchování na pevné půdě se mikroorganismy nejdříve pomnoží v kapalném médiu.Očkovací klička se vysterilizuje v oxidační části plamene a nechá se ochladit na okraji pevné půdy. Pak se očkovací kličkou asepticky přenese kapka média s buněčnou suspenzí na pevný agar v Petriho misce a rozčárkuje se. Do druhé sady Petriho misek se automatickou pipetou asepticky přenese 0,5 ml buněčné suspenze, která se rozetře na agarovou půdu sterilní hokejkou. Petriho misky se popisují a přenesou do termostatu, kde se nechají inkubovat v obrácené poloze při 37 °C po dobu 24 hodin. Po kontrole nárůstu se Petriho misky přemístí do lednice a uchovávají při teplotě 4°C.

  Příprava kultivačního média

Jednotlivé složky média se naváží a rozpustí v destilované vodě. Médium se rozlije do Erlenmayerových baněk, baňky se uzavřou zátkou. Zátky se zabalí do alobalu a baňky se vysterilují v autoklávu při 120 °C po dobu 20 minut. Každá porce MgCO₃ se vysteriluje zvlašt v alobalovém obalu. Takto připravené médium se uchovává při teplotě 4 °C.

Příprava kultivačního média pro stanovení optimální koncentrace glukózy

Produkční médium, podle článku Kuhnert a kol., 2009, v g l^-1:

·         kvasničný extrakt (Merck, Německo) 5

·         sójový pepton (Carl Roth, Německo) 5

·         (NH₄)₂SO₄ 1

·         CaCl₂·2H₂O 0,2

·         MgCl₂·6H₂O 0,2

·         NaCl 1

·         K₂HPO₄ 3

·         MgCO₃ 10

Koncentrace glukózy 20, 30, 50 resp. v každém vzorku. Každá  jednotlivá fermentace byla zopakována třikrát.

 Příprava kultivačního média pro stanovení optimální koncentrace MgCO₃

Erlenmayerovy baňky se naplní 50 ml produkčního média s koncentrací glukózy 30 g l^-1. Koncentrace MgCO₃ byla 5, 10, 15 g l^-1 resp. v každém vzorku. Každá jednotlivá fermentace byla zopakována třikrát.

 Příprava kultivačního média pro stanovení optimálního zdroje uhlíku

Erlenmayerovy baňky se naplní 50 ml produkčního média. Jako zdroj uhlíku byl použit glycerol v koncentraci 20 g l^-1, směs glycerol – glukóza (1:1) 20 g l^-1, sacharóza 20 g l^-1, glukóza 20 g l^-1. Každá jednotlivá fermentace byla zopakována třikrát.

 Příprava kultivačního média pro stanovení optimálního komplexního zdroje dusíku

Produkční médium 1, podle članku Kuhnert a kol., 2009, v g l^-1:

·         kvasničný extrakt (Merck, Německo) 5

·         sójový pepton (Carl Roth, Německo) 5

·         (NH₄)₂SO₄ 1

·         CaCl₂·2H₂O 0,2

·         MgCl₂·6H₂O 0,2

·         NaCl 1

·         K₂HPO₄ 3

·         MgCO₃ 15

·         sacharóza 20

Produkční médium 2, podle članku Kuhnert a kol., 2009, v g l^-1:

·         kvasničný extrakt (Merck, Německo) 5

·         „corn steep liquor“ (Sigma-Aldrich, USA) 6,7

·         (NH₄)₂SO₄ 1

·         CaCl₂·2H₂O 0,2

·         MgCl₂·6H₂O 0,2

·         NaCl 1

·         K₂HPO₄ 3

·         MgCO₃ 15

·         sacharóza 20

Každá jednotlivá fermentace byla zopakována třikrát.

 Příprava inokulačního média pro kultivace v bioreaktoru

Inokulační médium, podle članku Kuhenert a kol., 2009, v g l^-1:

·         kvasničný extrakt (Merck, Německo) 5

·         sójový pepton (Carl Roth, Německo) 5 nebo „corn steep liquor“ (Sigma-Aldrich, USA) 6,7

·         (NH₄)₂SO₄ 0,2

·         CaCl₂·2H₂O 0,2

·         MgCl₂·6H₂O 0,2

·         NaCl 1

·         K₂HPO₄ 3

·         MgCO₃ 15

·         sacharóza 20 nebo melasa 40

Produkční médium 3, podle članku Kuhnert a kol., 2009, v g l^-1:

·         kvasničný extrakt (Merck, Německo) 5

·         sójový pepton (Carl Roth, Německo) 5 nebo „corn steep liquor“ (Sigma-Aldrich, USA) 6,7

·         (NH₄)₂SO₄ 1

·         CaCl₂·2H₂O 0,2

·         MgCl₂·6H₂O 0,2

·         NaCl 1

·         K₂HPO₄ 3

·         MgCO₃ 15

·         sacharóza 30,40,50 nebo melasa 60, 80, 100

 Kultivace v Erlenmayerových baňkách

Erlenmayerovy baňky s 50 ml kultivačního média se v očkovacím boxu asepticky zaočkují glycerolovou konzervou. Glycerolová konzerva se vyjme z hlubokomrazicího boxu, umístí se do stojánku a nechá pomalu rozmrazit. Poté je uzavřená konzerva promíchána ve vortexu a její obsah se asepticky v očkovacím boxu přelije do připravené Erlenmayerovy baňky s médiem. Baňka se uzavře zátkou a obsah se krouživým pohybem promíchá. Kultivace probíhala v anaerobní komoře Concept 400 (Technology Centre, Velká Británie) při teplotě 37 °C po dobu 15 hodin. Stálá hodnota pH byla udržována pomocí 15 g l^-1 MgCO₃ v médiu.

 Kultivace v bioreaktoru

Kultivace anaerobních mikroorganismů probíhala vsádkově v bioreaktoru Multiforce (Inforce HT, Inforce HT, Švysarsko) s celkovým objemem reaktoru 1,4 l. Po kalibraci pH a redoxní elektrody byla nádoba fermentoru, která v té době obsahovala 600 ml media, vysterilizována v autoklávu. Po vychladnutí byl přístroj znovu spuštěn a nastavily se podmínky optimální pro kultivaci: průtok CO₂ 0,5 l min^-1, míchání 250 min^-1 a teplota 37°C. Jako inokulum sloužilo 120 ml kultury, vyrostlé v baňkách. Série vsádkových kultivaci probíhala s  počáteční koncentrací sacharózy 30  a 50 g l^-1, melasy 80 a 100 g l^-1. Během experimentů se kontinuálně měřily a regulovaly následující veličiny: teplota média, pH média, redoxní potenciál, průtok CO₂, rychlost otáček míchadla, dodávka neutralizačního a odpěňovacího prostředku. Hodnota pH byla udržována pomocí 10% roztoku NaOH nebo přímou dodávkou MgCO₃ do média před inokulaci, jako odpěňovací prostředek se používal 30% roztok polypropylenglykolu.

 HPLC analýza vzorků

Během každého pokusu byly v průběhu kultivace v baňkách i bioreaktoru odebírány vzorky, které byly následně analyzovány pomocí metody HPLC. Byla stanovena koncentrace produktů kultivace a úbytku substrátu pro každý jednotlivý pokus.

 Příprava vzorků z produkčních médií

Po ukončení kultivace se v očkovacím boxu z každé Erlenmayerovy baňky odebere 1 ml buněčné suspenze do připravených Eppendorfových zkumavek. Z každého vzorku se sterilně připraví mikroskopický preparát, který se pak kontroluje pod mikroskopem (viz. kapitola 2.1). Po mikroskopické kontrole se vzorky odstředí na odstředivce Micro 22OR (Nemecko)  při 10000 rpm po dobu 5 min. Supernatant se slije do Eppendorfových zkumavek, označených číslem vzorku, a nechá se zmrazit na -20 °C. Před analýzou se vzorky nechají rozmrazit při pokojové teplotě, následně se každý vzorek přefiltruje přes mikrofiltr s velikostí pórů 0,2 µm do vialky opatřené zátkou.

 Příprava kalibračních roztoků

Připraví se kalibrační roztoky glukózy a také metabolitů, které by se při kultivaci mohly produkovat. Jsou to roztoky kyseliny jantarové, mléčné, mravenčí a octové. Koncentrační rozsahy jsou vybrány podle předchozích zkušeností z vědeckých článků. Jednotlivé látky se navažují přesně na analytických vahách a rozpustí se v demineralizované vodě. Tímto způsobem připravené roztoky se rozpipetují do Eppendorfových zkumavek a uchovají se při -20 °C.

 Příprava mobilní fáze

Jako mobilní fáze pro analýzu vzorků se používá 1 mM H₂SO₄, která se připraví s použitím demineralizované vody. Objem mobilní fáze vypočteme podle počtu vzorků, doby analýzy jednoho vzorku, což přibližně je 30 minut, průtoku mobilní fáze – 0,5 ml min^-1, a přidá se rezerva na promytí přístroje cca 200 ml. Mobilní fáze se nalije do šroubovací lahve, otevřená láhev se umístí do ultrazvukové lázně a roztok se nechá 20 min. odplynit. HPLC analýza probíhala na přistroji Agilent Series 1200 HPLC (Agilent, Španělsko), s použitou kolonou Watrex 250×8 mm polymer IEX SN7550 H⁺ a refraktometrickým detektorem.

 Přístroje a zařízení

·         Anaerobní komora (Concept 400, UK)

·         Anaerostat, náplňě (Anaerocult, Merck, Německo)

·         Analytické váhy (HA-180 M, A&D Company, Japonsko)

·         Autokláv (Tuttnauer Company ELV 3170, USA)

·         Automatická pipeta (Biohit mLINE,Biohit, FIN)

·         Bioreaktor Biostat® A (B.Braun Biotech International), Multiforce 1-6 (Inforce HT, Švycarsko)

·         Digitální pH metr (330/Set,, WTW, GmbH, Německo)

·         Digitální fotoaparát (Camedia C-5050ZOOM, Olympus, Japonsko)

·         Erlenmayerovy baňky (100 ml)

·         Sterilní box (Hotte MSC.9 STD GAZ Jouan, Francie a dále HERASAFE KS 12, Německo)

·         HPLC (Agilent Technologies 1200 series, Agilent Technologies, USA)

·         Magnetické míchadlo MM 3 (Laboratorní přistroje Praha, ČR)

·         Mikroskop (BX51, Olympus, Japonsko)

·         Odstředivka (Mikro 22OR, Germany)

·         Ultrazvuková lázeň (Transsomic 420 Elma, Německo)

·         Zařizení pro připravu demineralizované vody Milli-Q (Millipore, USA)

 Výpočet směrodatné odchylky, výtěžnosti a produktivity

Pro výpočetvýtěžnosti produktu vztažené na utilizovaný susbtrát se používá následující vzorec:

Y_p/s=(C_k/(S₀-S_k))*100%;

Kde Y_p/s- výtěžnost na spotřebovaný substrát,

C_k – konečná koncentrace produktu, g l^-1,

S_{0 -} počáteční koncentrace substrátu, g l^-1,

S_k - konečná koncentrace substrátu, g l^-1.

Výpočet produktivity vsádkové kultivace

P= C_k/T;

kde C_k – konečná koncentrace produktu, g l^-1,

T- doba kultivace, h.